《現(xiàn)代生物農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)：動(dòng)物源抗菌肽》：
　　第一章 抗菌肽概述
　　抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），又稱抗微生物肽或宿主防御肽（host defensive peptide，HDP），是自然界生物體內(nèi)廣泛存在的小分子多肽，具有抵抗外源病原體感染的活性，是宿主天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分�？咕�肽廣泛分布于動(dòng)物、植物和人的體內(nèi)，同時(shí)因其高活性、低毒性、抗菌譜廣和低耐藥性等特點(diǎn)而成為抗生素替代品的后起之秀。
　　起初分離的抗菌活性多肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜、高效的抗菌活性，被人們稱為“antibacterial peptide，ABP”，中文譯為抗細(xì)菌肽，簡(jiǎn)稱抗菌肽。但是，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)抗菌肽還具有抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、抗癌細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)等功能，故將這類活性多肽稱為“peptide antibiotics”，中文譯為多肽抗生素或肽抗生素�！半目股�素”較好地概括了這類活性多肽的功能特征，被多數(shù)學(xué)者所推崇。在國內(nèi)，各種期刊文章中關(guān)于這類活性多肽均稱為抗菌肽。同時(shí)，在國外的期刊和書籍等文獻(xiàn)中，抗菌肽的英文為“antimicrobial peptide，AMP”。因此，為了與國際接軌，本書將抗菌肽的英文譯為“antimicrobial peptide，AMP”。
　　第一節(jié) 抗菌肽的研究簡(jiǎn)史
　　一、尋找抗生素替代品的必然性
　　自20世紀(jì)40年代第一個(gè)抗生素——青霉素被發(fā)現(xiàn)后，人類迎來了治療傳染病的曙光。隨著研究的深入和臨床的需要，人類又相繼開發(fā)了多種抗菌藥物。這些抗菌藥物在治療人類和動(dòng)物疾病方面作出了不可磨滅的歷史貢獻(xiàn)。
　　但是，由于抗生素的廣泛使用，臨床上不斷出現(xiàn)耐藥菌甚至多重耐藥菌，使得細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療成為一大難題。這已引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前，這個(gè)問題越來越嚴(yán)重，已經(jīng)成為治療感染性疾病的最大障礙。據(jù)報(bào)道，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)已達(dá)到住院感染患者總?cè)藬?shù)的30%左右。近年來，細(xì)菌的耐藥性和耐藥譜仍在以驚人的速度增長和擴(kuò)展。特別是具有多藥物抗性（multidrug resistance，MDR）的超級(jí)細(xì)菌在世界范圍內(nèi)的相繼出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的生命安全與健康。因此，人類迫切需要開發(fā)新抗生素來解決細(xì)菌的耐藥性問題。人類開始對(duì)傳統(tǒng)抗生素進(jìn)行改造以降低耐藥性，并不斷開發(fā)新型抗生素。然而，新抗生素的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上耐藥菌的出現(xiàn)速度，而且新抗生素的開發(fā)不僅花費(fèi)高，還需要經(jīng)過漫長臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。另外，從2006年1月開始，歐盟全面禁止食品動(dòng)物使用抗生素類促生長飼料添加劑。在這種形勢(shì)下，尋找具有安全、有效及不易產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代物成為必然選擇。
　　在尋找抗生素替代物的過程中，人們逐漸把目光投向抗菌肽，認(rèn)為抗菌肽有望成為傳統(tǒng)抗生素的替代物。因?yàn)�，抗菌肽的作用機(jī)制完全不同于傳統(tǒng)抗生素，其能殺死耐藥菌及其突變株，而且在使用過程中不易形成具有耐藥性的突變株。再者，抗菌肽在使用過程中無不良作用。因此，對(duì)抗菌肽的研究成為必然趨勢(shì)。20世紀(jì)90年代以來，對(duì)抗菌肽的研究、開發(fā)和利用一直是國際生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。
　　二、抗菌肽研究簡(jiǎn)況
　　1922年，F(xiàn)laming（弗萊明）在急性鼻炎患者的鼻腔分泌物中分離出一種具有殺菌功能的溶菌酶，是首次在人體內(nèi)分離的可溶性抗菌物質(zhì)（朱鈞萍等，2013）。1939年，Dubos從芽胞桿菌的培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)了短桿菌肽（gramicidin），對(duì)革蘭陽性菌具有極強(qiáng)的殺傷作用，這個(gè)短桿菌肽后來被證實(shí)是一種由L-型及D-型氨基酸交替組成的N-甲�；�多肽，是首個(gè)明確一級(jí)結(jié)構(gòu)的抗菌肽（朱鈞萍等，2013）。1962年，國外科學(xué)家在研究蟾蜍的皮膚分泌物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種未知的可以抗菌的物質(zhì)，經(jīng)分析是一種肽類物質(zhì)。1963年，首次從釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)嗜殺毒素。1972年，瑞典科學(xué)家Boman等在惜古比天蠶（Hyalophora cecropia）中發(fā)現(xiàn)了一類肽類物質(zhì)，稱為天蠶素（cecropin），并確定了天蠶素A和天蠶素B的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序（Boman，1995）。此后，人們又相繼在細(xì)菌、真菌、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、植物和人類中發(fā)現(xiàn)并分離得到了相似的抗菌肽類物質(zhì)，并稱為抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）。Lee等（1997）從柄海鞘（Styela clava）的血細(xì)胞中分離得到的clavanin是α螺旋抗菌肽的典型代表。clavanin含有1~2個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，不含半胱氨酸殘基，其抗菌活性很高，對(duì)哺乳動(dòng)物無細(xì)胞毒性。杜衛(wèi)等（2000）利用RP-HPLC從櫛孔扇貝中分離得到4個(gè)小分子多肽。
　　到目前為止，已經(jīng)鑒定出來2000多種抗菌肽，并且每年都以很高的速度增長。這些抗菌肽來自脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、微生物和人類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽中，絕大多數(shù)為陽離子型抗菌肽，這些陽離子型抗菌肽具有廣譜的抗微生物活性，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒、抗腫瘤等。
　　隨著科學(xué)界對(duì)抗菌肽研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)抗菌肽是自然界長期進(jìn)化而來的，存在于很多生物體內(nèi)的一種天然物質(zhì)，具有非特異性抗病原微生物作用、天然免疫調(diào)節(jié)作用和其他多種生物活性功能，是生物非特異性免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，是一種天然抗病因子。隨著對(duì)抗菌肽作用與功能研究和發(fā)現(xiàn)的增多，也有將抗菌肽重新命名為“抗微生物肽”、“防御素”和“宿主防御肽”的情況。
　　近幾年來，抗菌肽的研究在理論和應(yīng)用上不斷得到拓展，抗菌肽的高效廣譜抗病原微生物作用和對(duì)提高動(dòng)物免疫力的顯著作用，得到了實(shí)驗(yàn)室及臨床使用的大量驗(yàn)證。目前，Genarea公司的Pexiganan已用于治療糖尿病足部潰瘍，Xoma公司開發(fā)的XMP.629和Neuprex分別用于治療痤瘡、腦膜炎，這幾個(gè)抗菌肽均已通過臨床Ⅲ期試驗(yàn)�？咕�肽的優(yōu)越性能顯示了其巨大的應(yīng)用前景。
　　但是，常態(tài)下動(dòng)物體內(nèi)抗菌肽的含量極低，分離提取難度極高，僅適合實(shí)驗(yàn)室研究使用，無法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，高昂的天然抗菌肽獲得成本制約了抗菌肽的實(shí)際應(yīng)用。而通過基因工程技術(shù)進(jìn)行抗菌肽的大規(guī)模表達(dá)，獲得效價(jià)高、性能穩(wěn)定的抗菌肽產(chǎn)品是一條切實(shí)可行的途徑。
　　第二節(jié) 抗菌肽的分類
　　一、根據(jù)抗菌肽結(jié)構(gòu)與氨基酸序列分類
　　1. β折疊抗菌肽
　　β折疊型抗菌肽具有反平行的β折疊結(jié)構(gòu)，在分子內(nèi)含有2~6個(gè)二硫鍵，二硫鍵存在于兩個(gè)構(gòu)成β折疊的肽段之間，起到穩(wěn)定抗菌肽結(jié)構(gòu)的作用，也有助于抗菌肽穿過細(xì)胞膜，但對(duì)抗菌肽的抗菌活性沒有影響[圖1-1（a）]。利用X射線晶體衍射研究人中性粒細(xì)胞中分離到的防御素（HNP-2）的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在晶體狀態(tài)下，防御素是以二聚體形式存在的，每個(gè)單體都有3股反平行的β折疊片以二硫鍵連接，不對(duì)稱的2個(gè)單體分子緊密靠近，并與二次旋轉(zhuǎn)軸對(duì)稱。
　　圖1-1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)示意圖
　　（a）β折疊結(jié)構(gòu)；（b）α螺旋結(jié)構(gòu)；（c）伸展螺旋結(jié)構(gòu)；（d）環(huán)狀結(jié)構(gòu)
　　具代表性的β折疊型抗菌肽是鱟素，它是從日本鱟紅細(xì)胞中提取的，由17~18個(gè)氨基酸殘基組成，在殘基3~8和16~11之間構(gòu)成反平行β折疊結(jié)構(gòu)，殘基3和16及7和12之間形成兩個(gè)二硫鍵。
　　動(dòng)物防御素也是β折疊型抗菌肽。β-防御素廣泛存在于不同的上皮組織中，可能參與上皮和黏膜的抗感染防御。
　　2. α螺旋抗菌肽
　　α螺旋抗菌肽含有一個(gè)跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)[圖1-1（b）]，這個(gè)跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)自身或者螺旋結(jié)構(gòu)聚合體介導(dǎo)抗菌肽誘發(fā)細(xì)菌內(nèi)容物的泄漏，使細(xì)胞死亡。在螺旋結(jié)構(gòu)中間含有小的彎曲。α螺旋抗菌肽不含半胱氨酸，不形成分子內(nèi)二硫鍵，N端富含親水性堿性氨基酸殘基，如賴氨酸和精氨酸，所帶正電荷有利于與細(xì)菌膜上的酸性磷脂頭負(fù)電荷作用而吸附到細(xì)菌膜上，C端含較多的疏水性氨基酸殘基，疏水性的尾部有利于抗菌肽插入細(xì)菌膜的雙層脂質(zhì)膜中。分子的兩端各形成一個(gè)兩親性α螺旋，2個(gè)α螺旋之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，這種α螺旋是破壞、裂解細(xì)菌的主要結(jié)構(gòu)，當(dāng)抗菌肽結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜上時(shí)，α螺旋相互聚集使細(xì)胞膜形成孔洞，細(xì)胞質(zhì)外溢而致細(xì)菌死亡。
　　這類抗菌肽的代表是magainin（根據(jù)讀音翻譯為“馬蓋寧”；其他譯名還有爪蟾抗菌肽、蛙皮素，容易使人混淆，故后文均使用英文表示），它是從蟾蜍皮膚中分離得到的，由23個(gè)氨基酸殘基組成，其中在12及13位氨基酸殘基附近出現(xiàn)一個(gè)彎曲結(jié)構(gòu)。在目前發(fā)現(xiàn)的所有的抗菌肽中，α螺旋抗菌肽的數(shù)量是最多的。
　　3. 伸展螺旋型抗菌肽
　　這類抗菌肽的氨基酸序列中不含半胱氨酸，但富含脯氨酸、精氨酸、色氨酸和甘氨酸，一般含有15~34個(gè)氨基酸殘基[圖1-1（c）]，在兩性分子內(nèi)部形成分子內(nèi)的α螺旋，不含取代基結(jié)構(gòu)，含有糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與其生物功能密切相關(guān)。這類抗菌肽主要通過肽與膜脂間的氫鍵或范德華力，而不是殘基間的氫鍵來發(fā)揮抗菌作用。
　　從牛中性粒細(xì)胞中分離的indolicidin抗菌肽只含有13個(gè)氨基酸殘基，其中包含5個(gè)色氨酸，它們位于多肽結(jié)構(gòu)的中心，對(duì)抗菌活性起著關(guān)鍵的作用。另外，蜂毒肽（melittin）富含甘氨酸。從蜜蜂體內(nèi)分離到的蜜蜂源抗菌肽（apidaecin）中脯氨酸和精氨酸的含量分別高達(dá)33%和17%。昆蟲防御素首先從肉蠅中分離得到，當(dāng)時(shí)認(rèn)為與哺乳動(dòng)物的防御素具有高度同源性而命名為昆蟲防御素（insect defensin）。但后來的研究表明，昆蟲防御素與哺乳動(dòng)物防御素二硫鍵的連接方式，以及三維空間構(gòu)型是截然不同的。
　　4. 具環(huán)狀結(jié)構(gòu)型抗菌肽
　　這類抗菌肽在C端有一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，形成一個(gè)環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，而N端則為線狀結(jié)構(gòu)[圖1-1（d）]。這一類抗菌肽有較強(qiáng)的抗菌活性。
　　青蛙皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的brevinin和牛的抗菌肽bactenecin均屬于此類。但是，牛中性粒細(xì)胞分泌的bactenecin是在分子的中部形成一個(gè)環(huán)鏈，兩端有1或2個(gè)游離的殘基。
　　5. 無規(guī)則結(jié)構(gòu)的抗菌肽
　　這類抗菌肽的結(jié)構(gòu)與規(guī)則的α螺旋或β折疊不同，呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲，富含一個(gè)或多個(gè)特殊氨基酸，有的呈伸展螺旋狀。例如，從凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中分離的penaeidin（一種類型的對(duì)蝦肽）富含脯氨酸，這些脯氨酸無規(guī)則地排列，形成一個(gè)無規(guī)則的卷曲結(jié)構(gòu)。
　　二、根據(jù)是否為天然來源分
　　1. 天然來源抗菌肽
　　從生物體內(nèi)分離到的抗菌肽為天然來源抗菌肽。迄今，科學(xué)家已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、高等植物、昆蟲、兩棲動(dòng)物、軟體動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、魚類、鳥類、哺乳動(dòng)物乃至人類中分離出上千種抗菌肽，這些都是天然來源的抗菌肽，產(chǎn)量極低。
　　2. 合成抗菌肽
　　通過化學(xué)合成技術(shù)或基因工程技術(shù)獲得的抗菌肽屬于合成抗菌肽。這類抗菌肽比天然抗菌肽的活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)和抑菌譜廣。
　　三、根據(jù)電荷分
　　按照抗菌肽分子表面的電荷的不同，主要將抗菌肽分為陽離子抗菌肽和陰離子抗菌肽。
　　1. 陽離子抗菌肽
　　陽離子抗菌肽在抗菌肽中占絕大多數(shù)。不同多肽的精氨酸和賴氨酸的數(shù)目不同，但至少有一個(gè)凈的二價(jià)正電荷。陽離子多肽在正常pH條件下均帶有正電荷。陽離子抗菌肽如LL-37、cecropin、magainin、凡納濱對(duì)蝦抗菌肽penaeidin-1~ penaeidin-3等。
　　2. 陰離子抗菌肽
　　陰離子抗菌肽在抗菌肽中為數(shù)不多，在生理pH條件下帶負(fù)電荷，如從細(xì)角濱對(duì)蝦血漿中分離的PsHct1和PsHct2，以及羊呼吸道組織中的表面活性物質(zhì)相關(guān)陰離子抗菌肽（surfactant-associated anionic peptide，SAAP）。
　　四、根據(jù)來源物種分
　　1. 微生物源抗菌肽
　　這類抗菌肽能殺死或抑制競(jìng)爭(zhēng)菌，對(duì)抗菌肽產(chǎn)生者自身卻無害，主要包括細(xì)菌素、酵母嗜殺毒素和病毒源抗菌肽。
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