基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的集中體現(xiàn)，該技術(shù)自誕生以來取得的杰出成就深刻影響和促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展和人類社會的進(jìn)步。基因工程不僅是生物技術(shù)專業(yè)和生物工程專業(yè)的主要專業(yè)課，也是生物科學(xué)專業(yè)必須學(xué)習(xí)和掌握的基本理論知識和基本研究技能之一，因此該課程在所有相關(guān)學(xué)科中占有重要地位。常重杰主編的《基因工程》本著“重視基礎(chǔ)、拓展眼界、聯(lián)系實(shí)際”的原則，對基因工程的基本概念和重要研究技術(shù)原理進(jìn)行了系統(tǒng)、翔實(shí)的介紹。同時，部分內(nèi)容結(jié)合教學(xué)實(shí)踐需要，介紹了該學(xué)科最新進(jìn)展，并提供了重要文獻(xiàn)和進(jìn)一步閱讀指南。
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《生命科學(xué)核心課程系列教材:基因工程》本著“重視基礎(chǔ)、拓展眼界、聯(lián)系實(shí)際”的原則，對基因工程的基本概念和重要研究技術(shù)原理進(jìn)行了系統(tǒng)、翔實(shí)的介紹。同時，部分內(nèi)容結(jié)合教學(xué)實(shí)踐需要，介紹了該學(xué)科最新進(jìn)展，并提供了重要文獻(xiàn)和進(jìn)一步閱讀指南。
《生命科學(xué)核心課程系列教材:基因工程》可作為師范院校、綜合性大學(xué)、農(nóng)林院校相關(guān)專業(yè)本科生教材，同時也可作為相關(guān)專業(yè)研究生和科技工作者的參考用書。
目錄
前言
第1章 緒論 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.2 基因工程的研究內(nèi)容 2
1.3 基因工程誕生的基礎(chǔ) 2
1.3.1 基因工程誕生的理論基礎(chǔ) 2
1.3.2 技術(shù)上的三大突破 3
1.4 基因工程技術(shù)的誕生 3
1.5 基因工程的應(yīng)用 5
1.5.1 原核細(xì)胞基因工程 5
1.5.2 植物基因工程 7
1.5.3 動物基因工程 8
1.5.4 基因治療 8
1.5.5 理論研究 9
1.6 基因工程的安全性 9
1.7 我國的《基因工程安全管理辦法》 11
思考題 12
參考文獻(xiàn) 13
第2章 基因工程的基本技術(shù) 14
2.1 凝膠電泳技術(shù) 14
2.1.1 基本原理 15
2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳 15
2.1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 17
2.1.4 脈沖場凝膠電泳 18
2.1.5 雙向電泳技術(shù) 20
2.1.6 凝膠電泳片段的回收與純化 21
2.2 分子雜交技術(shù) 22
2.2.1 分子雜交的原理 22
2.2.2 分子雜交的類型 24
2.3 PCR技術(shù) 26
2.3.1 PCR基本原理和反應(yīng)過程 26
2.3.2 PCR反應(yīng)的體系及其設(shè)計和優(yōu)化 28
2.3.3 PCR產(chǎn)物的克隆 31
2.3.4 PCR技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用 36
2.4 DNA序列分析 47
2.4.1 Maxam Gibert化學(xué)降解法 47
2.4.2 Sanger雙脫氧鏈終止法 49
2.4.3 DNA序列分析的自動化 50
2.4.4 DNA序列的生物信息學(xué)分析 52
2.5 基因芯片及數(shù)據(jù)分析 53
2.5.1 基因芯片概念 54
2.5.2 技術(shù)原理 54
2.5.3 基因芯片的制備 54
2.5.4 基因芯片的應(yīng)用 55
2.6 研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法 57
2.6.1 酵母單雜交系統(tǒng)（可延伸雙雜交） 57
2.6.2 凝膠阻滯試驗(yàn)（Gel shift） 57
2.6.3 DNase工足跡法 58
2.6.4 噬菌體展示技術(shù) 58
思考題 59
參考文獻(xiàn) 59
第3章 基因工程的工具酶 61
3.1 限制性內(nèi)切核酸酶 62
3.1.1 限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)與種類 62
3.1.2 限制性內(nèi)切核酸酶的命名 63
3.1.3 Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的基本特性 63
3.1.4 影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的因素 66
3.1.5 限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA的方法 68
3.2 DNA連接酶 68
3.2.1 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) 68
3.2.2 DNA連接酶的種類 69
3.2.3 黏性末端DNA片段的連接 69
3.2.4 平末端DNA片段的連接 71
3.2.5 影響連接反應(yīng)的因素 73
3.3 DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 74
3.3.1 大腸桿菌DNA聚合酶工及其應(yīng)用 75
3.3.2 E.coli DNA聚合酶工的Klenow大片段酶及其應(yīng)用 76
3.3.3 T4噬菌體DNA聚合酶 77
3.3.4 T，噬菌體DNA聚合酶與測序酶 77
3.3.5 反轉(zhuǎn)錄酶 78
3.4 修飾酶類 79
3.4.1 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 79
3.4.2 T4多核苷酸激酶 79
3.4.3 堿性磷酸酶 79
3.5 其他工具酶 80
3.5.1 S1核酸酶 80
3.5.2 Bal 31核酸酶 81
3.5.3 核酸外切酶 82
3.5.4 RNA酶 83
思考題 84
參考文獻(xiàn) 84
第4章 基因工程的克隆載體 85
4.1 質(zhì)粒載體 86
4.1.1 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性 86
4.1.2 質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制 89
4.1.3 質(zhì)粒DNA的分離與純化 91
4.1.4 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型 92
4.1.5 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 95
4.1.6 質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題 99
4.2 噬菌體載體 100
4.2.1 噬菌體的一般生物學(xué)特性 100
4.2.2 入噬菌體載體 103
4.2.3 單鏈DNA噬菌體載體 107
4.3 柯斯質(zhì)粒載體 112
4.3.1 柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其特點(diǎn) 112
4.3.2 柯斯克隆 113
4.3.3 柯斯克隆的改良 114
4.4 噬菌粒載體 116
4.4.1 噬菌粒載體的概念 116
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒載體 117
4.4.3 pBluescript噬菌粒載體 118
4.5 人工染色體克隆載體 119
4.5.1 構(gòu)建大容量載體的必要性 119
4.5.2 人工染色體的必需成分 120
4.5.3 酵母人工染色體載體 120
4.5.4 細(xì)菌人工染色體載體 122
4.5.5 Pl人工染色體 123
4.5.6 人類人工染色體 123
4.5.7 植物人工染色體 124
思考題 124
參考文獻(xiàn) 125
第5章 目的基因的獲取與改造 126
5.1 DNA的人工合成 126
5.1.1 人工合成DNA的原理 126
5.1.2 人工合成DNA的應(yīng)用 128
5.2 從基因文庫獲取目的基因 130
5.2.1 基因組文庫的構(gòu)建與篩選 130
5.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建與篩選 136
5.2.3 基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別 140
5.3 PCR技術(shù)與目的基因的分離 141
5.3.1 目的基因的直接擴(kuò)增和克隆 141
5.3.2 目的基因的cDNA的克隆 141
5.4 電子克隆獲取目的基因 141
5.4.1 電子克隆的基本原理 142
5.4.2 利用EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子克隆 142
5.4.3 利用基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子克隆 143
5.4.4 全長cDNA的判斷 143
5.5 根據(jù)基因差異表達(dá)獲得目的基因 143
5.5.1 mRNA差異顯示技術(shù)． 143
5.5.2 cDNA代表性差異分析 145
5.5.3 抑制差減雜交技術(shù) 145
5.6 目的基因的改造 147
5.6.1 基因突變與人工誘變技術(shù) 147
5.6.2 基因走點(diǎn)誘變 149
5.6.3 基因隨機(jī)突變 151
思考題 153
參考文獻(xiàn) 153
第6章 目的基因的導(dǎo)入與重組體的鑒定 155
6.1 重組DNA向原核細(xì)胞的導(dǎo)入． 155
6.1.1 原核受體細(xì)胞的種類及特點(diǎn) 155
6.1.2 轉(zhuǎn)化 156
6.1.3 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌 157
6.1.4 重組入噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 160
6.2 重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞 16l
6.2.1 真核受體細(xì)胞 161
6.2.2 重組DNA分子導(dǎo)入酵母細(xì)胞 162
6.2.3 重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞 162
6.2.4 重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 164
6.3 重組體克隆的篩選與鑒定 167
6.3.1 載體遺傳標(biāo)記篩選法 167
6.3.2 依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法 171
6.3.3 核酸分子雜交檢測法 172
6.3.4 免疫化學(xué)檢測法 174
6.3.5 翻譯篩選法 175
6.3.6 亞克隆法 176
6.3.7 插入失活法 176
6.3.8 電子顯微鏡作圖檢測法 177
6.3.9 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作圖 177
6.3.10 基因表達(dá)產(chǎn)物分析法 177
6.3.11 DNA序列測定法 178
思考題 179
參考文獻(xiàn) 179
第7章 外源基因的原核表達(dá)系統(tǒng) 180
7.1 原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 180
7.1.1 原核生物的轉(zhuǎn)錄 180
7.1.2 原核生物的翻譯 181
7.2 原核細(xì)胞表達(dá)體系 182
7.2.1 大腸桿菌表達(dá)體系 182
7.2.2 芽孢桿菌表達(dá)體系 185
7.2.3 鏈霉菌表達(dá)體系 186
7.2.4 藍(lán)藻表達(dá)體系 188
7.3 提高外源基因表達(dá)水平的措施 190
7.3.1 優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計 190
7.3.2 避免使用稀有密碼子 190
7.3.3 提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性 190
7.3.4 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解 191
7.3.5 減輕細(xì)脆的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平 191
7.3.6 優(yōu)化發(fā)酵條件 191
7.4 利用原核細(xì)胞生產(chǎn)真核蛋白質(zhì)的實(shí)例 191
7.4.1 干擾素基因工程 191
7.4.2 生長激素基因工程 192
7.4.3 生長激素釋放抑制因子基因工程 193
7.4.4 胰島素基因工程 194
7.4.5 α-淀粉酶基因工程 195
7.5 目的蛋白的純化 197
7.5.1 組氨酸標(biāo)簽 197
7.5.2 GST 標(biāo)簽 198
7.5.3 MBP標(biāo)簽 199
7.5.4 IMPACT 199
7.5.5 TAP 標(biāo)簽 200
思考題 201
參考文獻(xiàn) 20l
第8章 外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng) 202
8.1 真核細(xì)胞表達(dá)體系的特點(diǎn) 202
8.1.1 利用真核細(xì)胞作宿主系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 202
8.2 酵母表達(dá)系統(tǒng) 203
8.2.1 酵母基因表達(dá)載體的構(gòu)成 203
8.2.2 酵母基因表達(dá)載體的種類 204
8.2.3 酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌 207
8.2.4 在酵母中高效表達(dá)外源基因的策略 207
8.3 昆蟲或昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系 208
8.3.1 以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)體系 209
8.3.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的效率與加工能力 209
8.3.3 一類穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 211
8.4 哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng) 212
8.4.1 哺乳動物基因表達(dá)載體的組成特征 213
8.4.2 哺乳動物基因表達(dá)載體 214
8.4.3 哺乳動物基因表達(dá)宿主細(xì)胞 220
8.4.4 提高哺乳動物基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率的因素 221
思考題 221
參考文獻(xiàn) 222
第9章 轉(zhuǎn)基因動物 223
9.1 轉(zhuǎn)基因動物發(fā)展簡史 223
9.2 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 225
9.2.1 外源基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法 225
9.2.2 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的新發(fā)展 234
9.3 轉(zhuǎn)基因動物的制備和檢測 240
9.3.1 以顯微注射小鼠為例介紹轉(zhuǎn)基因動物的制備 240
9.3.2 轉(zhuǎn)基因的鑒定和表達(dá)水平檢測 241
9.4 轉(zhuǎn)基因動物研究中出現(xiàn)的問題及其對策 243
9.4.1 轉(zhuǎn)基因動物效率極低 243
9.4.2 難以控制轉(zhuǎn)基因在寄主基因組的行為 244
9.4.3 大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平極低 244
9.4.4 轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征及提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的策略 245
9.5 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 246
9.5.1 在生產(chǎn)和生活中的應(yīng)用 246
9.5.2 在生物制藥方面的應(yīng)用——動物生物反應(yīng)器 247
9.5.3 在疾病研究中的應(yīng)用 249
9.5.4 在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用 250
9.6 轉(zhuǎn)基因動物的安全性及其未來 250
9.6.1 食品安全性 251
9.6.2 環(huán)境安全性 25l
思考題 252
參考文獻(xiàn) 252
第10章 轉(zhuǎn)基因植物 254
10.1 轉(zhuǎn)基因植物概述 254
10.2 轉(zhuǎn)基因植物的基因轉(zhuǎn)化方法 255
10.2.1 轉(zhuǎn)基因植物受體系統(tǒng) 255
10.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù) 256
10.2.3 DNA直接導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)化技術(shù) 262
10.2.4 花粉管通道法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù) 264
10.3 轉(zhuǎn)基因植物的檢測方法 265
10.3.1 基于報告基因／選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物檢測方法 265
10.3.2 基于報告基因的轉(zhuǎn)基因植物的外源基因表達(dá)檢測 266
10.3.3 外源目的基因整合的鑒定 267
10.4 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 268
10.4.1 來源于微生物的抗蟲基因 268
10.4.2 來源于植物的抗蟲基因的應(yīng)用 270
10.5 抗細(xì)菌轉(zhuǎn)基因作物 272
10.5.1 裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 272
10.5.2 破壞細(xì)菌細(xì)胞膜 273
10.5.3 解除細(xì)菌毒素的毒性作用 274
10.5.4 引入對細(xì)菌毒素不敏感的靶酶 274
10.5.5 增強(qiáng)植物本身的防衛(wèi)蛋白合成 274
10.6 抗病毒轉(zhuǎn)基因作物 275
10.6.1 利用非病毒來源的抗病毒基因策略 275
10.6.2 利用病毒來源基因的抗病毒策略 276
10.7 抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物 279
10.7.1 增加靶標(biāo)酶或靶標(biāo)蛋白的拷貝數(shù) 279
10.7.2 作用靶標(biāo)酶的修飾 279
10.7.3 分離能解除除草劑毒性的酶基因 280
10.7.4 新型除草劑的發(fā)展方向 280
10.8 抗逆境轉(zhuǎn)基因作物 280
10.8.1 抗干旱脅迫策略 280
10.8.2 抗寒凍脅迫策略 281
10.8.3 抗鹽堿脅迫策略 282
10.9植物生物反應(yīng)器 282
10.9.1 植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn) 282
10.9.2 植物生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀 283
10.9.3 植物生物反應(yīng)器存在的問題 283
10.10 轉(zhuǎn)基因沉默的原因及對策 284
10.10.1 轉(zhuǎn)基因沉默的原因 284
10.10.2 控制轉(zhuǎn)基因沉默的策略 285
10.11 轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價 285
10.11.1 轉(zhuǎn)基因植物食品的安全性評價 286
10.11.2 轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)環(huán)境的安全性評價 288
思考題 290
參考文獻(xiàn) 290
第11章 基因治療 291
11.1 基因治療的基本概念 291
11.2 基因治療的發(fā)展簡史與現(xiàn)狀 291
11.3 基因治療的策略 294
11.3.1 根據(jù)基因?qū)塍w內(nèi)的方式 294
11.3.2 根據(jù)導(dǎo)入基因發(fā)生作用的方式 295
11.4 基因治療的流程 295
11.4.1 目的基因的準(zhǔn)備 295
11.4.2 靶細(xì)胞 295
11.4.3 載體的選擇 295
11.4.4 轉(zhuǎn)移技術(shù) 296
11.5 基因治療的應(yīng)用 304
11.5.1 腫瘤的基因治療 305
11.5.2 單基因病的基因治療 312
11.5.3 艾滋病等感染性疾病的基因治療 315
11.6 基因治療的前景 316
11.6.1 基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn) 316
11.6.2 基因治療的發(fā)展方向 317
思考題 317
參考文獻(xiàn) 317
第12章 合成生物學(xué)與基因工程 319
12.1 合成生物學(xué) 319
12.1.1 合成生物學(xué)的定義 319
12.1.2 合成生物學(xué)的研究內(nèi)容 320
12.1.3 合成生物學(xué)的工程本質(zhì) 325
12.1.4 合成生物學(xué)的意義 327
12.1.5 合成生物學(xué)的應(yīng)用 328
12.2 合成生物學(xué)與基因工程 331
12.2.1 合成生物學(xué)與基因工程的差異 332
12.2.2 合成生物學(xué)與基因工程相似之處 333
思考題 334
參考文獻(xiàn) 334
附錄 總復(fù)習(xí)題 335
在實(shí)際應(yīng)用方面，生物芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領(lǐng)域。在疾病診斷方面，由博奧生物有限公司研發(fā)的多重等位基因特異性PCR通用芯片（allele—specific PCR—baseduniversal array，ASPUA），可在5h之內(nèi)完成導(dǎo)致遺傳性耳聾的4種常見基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體基因）的檢測；我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院已先后研制出快速檢測甲型H1N1流感病毒檢測基因芯片以及專門針對甲型H1N1流感病毒抗藥性的基因確診和耐藥性分析的基因芯片等。在司法方面，便攜式DNA芯片檢測裝置可以直接在犯罪現(xiàn)場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、精液等進(jìn)行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存蓄的DNA“指紋”進(jìn)行比較，進(jìn)行快速準(zhǔn)確地破案。在藥物篩選方面，博奧生物芯片有限公司研發(fā)的“超高通量藥物篩選芯片”每小時能做380個細(xì)胞分析，而一個科研人員一天最多只能分析五六個細(xì)胞，這意味著藥物研發(fā)效率的飛躍，同時新藥物研發(fā)費(fèi)用也大大降低。在農(nóng)林方面，目前已利用基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行了植物激素的中心作用、植物基因與環(huán)境的相互影響、多種因素（肥力、種子、環(huán)境耐受力和抗蟲害等）與植物基因表達(dá)的關(guān)系的研究，最終有可能用生物芯片技術(shù)取代現(xiàn)在沿用的費(fèi)時費(fèi)錢的大田試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ｔ谑称钒踩矫�，世界上第一個能夠檢測肉類中獸藥殘留的生物芯片系統(tǒng)在北京國家工程研究中心研制成功，該芯片能夠分析大量的生物分子，快速準(zhǔn)確地完成肉類中獸藥殘留的檢測工作。目前，美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院已開發(fā)出檢測環(huán)境有毒物的毒理芯片去評估未知化合物或混合物的潛在危害。在國防方面，生物戰(zhàn)劑與化學(xué)戰(zhàn)劑的偵檢是一項(xiàng)很復(fù)雜且又十分重要的工作，可以采用基因芯片技術(shù)檢測細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、立克次氏體等微生物；隨著許多威脅人類健康的疾病基因、各種與體能有關(guān)基因及機(jī)體對特殊環(huán)境的適應(yīng)基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，使得分子選兵成為可能，生物芯片將廣泛用于分子選兵，尤其是對特種士兵的篩選以及軍人體能評價等領(lǐng)域。
總之，隨著大規(guī)�；蚪M測序的完成，生物學(xué)家開始從相對靜態(tài)的基因組研究轉(zhuǎn)向更為動態(tài)的基因表達(dá)過程研究。通過對不同細(xì)胞類型之間表達(dá)模式差異的研究，可以從動態(tài)的角度刻畫出一幅生命活動的“動畫”，來進(jìn)一步探索生命的奧秘。在這一過程中，芯片技術(shù)展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景�；蛐酒瑢槿祟愓J(rèn)識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進(jìn)化，為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐平臺。
2.6 研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法
DNA—蛋白質(zhì)相互作用的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的主要課題之一，涉及了多學(xué)科前沿交叉領(lǐng)域里的相關(guān)知識和技術(shù)方法。弄清DNA—蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制，對我們了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達(dá)機(jī)制，揭示各種生命活動現(xiàn)象具有極其重要的指導(dǎo)作用。研究DNA蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法主要包括凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酵母單雜交體系、DNase Ⅰ足跡實(shí)驗(yàn)、噬菌體展示技術(shù)和熒光技術(shù)等。
2.6.1酵母單雜交系統(tǒng)（可延伸雙雜交）
該技術(shù)是由J.J.Li和I.Herskowitz從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展來的。它通過對酵母細(xì)胞內(nèi)報告基因表達(dá)狀況的分析，來鑒定DNA順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況；通過篩選DNA文庫來獲得與靶序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì)基因序列。它的原理（圖2—28）是：根據(jù)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA—binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD），且兩結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用的特點(diǎn)，來設(shè)計攜帶有編碼“靶蛋白”的文庫質(zhì)粒，從而使文庫蛋白編碼基因置換酵母原有轉(zhuǎn)錄因子CAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并通過表達(dá)的“靶蛋白”與目的基因相互作用來激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。由此可見，該系統(tǒng)需包含：①將文庫蛋白的編碼基因與轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒；②含目的基因與下游報告基因的報告質(zhì)粒。其中，文庫的設(shè)計和篩選實(shí)驗(yàn)是整個酵母單雜交系統(tǒng)的核心技術(shù)。
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