第一篇　常用儀器及基本實驗技術(shù)
本篇主要介紹顯微形態(tài)學(xué)實驗的常用儀器和基本實驗方法，包括多種顯微鏡的構(gòu)造和使用方法，常用切片制作技術(shù)和染色方法，免疫組化、組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及常用電鏡技術(shù)等。
第一章　光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用
一、普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用
1. 成像原理與構(gòu)造　光學(xué)顯微鏡利用凸透鏡放大成像原理，將肉眼不能分辨的微小物體通過物鏡、目鏡兩次放大成像，便于人們提取觀察對象的微細(xì)結(jié)構(gòu)信息。普通光學(xué)顯微鏡由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩部分構(gòu)成（圖1-1-1）。
圖1-1-1　普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖
（1）機械裝置
1）鏡座：位于顯微鏡底部，支持全鏡。
2）鏡柱：下端連鏡座，上端與鏡臂相連。
3）鏡臂：呈弓形，位于鏡柱上方，支持鏡筒，是取用顯微鏡時握拿的部位。
4）鏡筒：位于鏡臂的前面，上端裝有目鏡，下端連旋轉(zhuǎn)盤。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，顯微鏡可分為單目鏡和雙目鏡兩類。
5）旋轉(zhuǎn)盤：又稱物鏡轉(zhuǎn)換器，為接于鏡筒下方的圓盤，其上嵌有3～4個物鏡，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，可調(diào)換不同放大倍數(shù)的物鏡。
6）載物臺：四方形或圓形平臺，供放置載玻片或標(biāo)本之用，中央有一通光孔。
7）片夾：載物臺上用于固定載玻片或標(biāo)本的鐮刀形彈簧夾，其左邊可以向外拉開。片夾常被固定在推片器的推進(jìn)齒條上。
8）推片器：是移動標(biāo)本的機械裝置，由一橫一縱兩個推進(jìn)齒輪和齒條構(gòu)成，調(diào)節(jié)推片器的旋鈕位于載物臺一側(cè)的下方，轉(zhuǎn)動旋鈕可以使載玻片前后左右移動。
9）調(diào)焦螺旋：粗調(diào)焦螺旋與細(xì)調(diào)焦螺旋合在一起，位于鏡臂上端或鏡柱兩側(cè)，轉(zhuǎn)動調(diào)焦螺旋可上下移動載物臺，從而調(diào)節(jié)焦距使之清晰成像。粗調(diào)焦螺旋（大螺旋）可使鏡筒或載物臺按垂直方向做較大距離的升降，用于低倍鏡觀察時的焦距調(diào)節(jié)。細(xì)調(diào)焦螺旋（小螺旋）可使鏡筒或載物臺做很小距離的升降，適用于高倍鏡和油鏡觀察時的清晰成像，其構(gòu)造精密，不宜旋轉(zhuǎn)過多、過快。
（2）光學(xué)系統(tǒng)
1）目鏡：裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡組成。亦分高倍與低倍兩種。高倍者較短，其上刻有10×或15×；低倍者較長，其上刻有5×或8×字樣。目鏡內(nèi)常裝有指針，用以指示視野中的某一目標(biāo)供他人觀察。
2）物鏡：裝于旋轉(zhuǎn)盤上，一般有低倍物鏡、高倍物鏡及油鏡三種。低倍鏡短，其上刻有10/0.25字樣，10代表該物鏡的放大倍數(shù)，0.25表示數(shù)值孔徑，物鏡的分辨率及放大倍數(shù)與數(shù)值孔徑成正比。標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短，物鏡與玻片間的距離越小。高倍鏡與油鏡較長，其上分別刻有40/0.65及100/1. 25等字樣（圖1-1-2）。當(dāng)物像清晰時，物鏡鏡面與蓋玻片上表面之間的距離稱工作距離。物鏡的放大倍數(shù)與其工作距離成反比（圖1-1-2）。當(dāng)?shù)捅剁R被調(diào)節(jié)到工作距離后，可直接轉(zhuǎn)換高倍鏡或油鏡，稍微調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)焦螺旋便可見到清晰的物像，這種情況稱為同高調(diào)焦。
光鏡的放大率等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積。
圖1-1-2　普通光學(xué)顯微鏡物鏡及其工作距離示意圖
3）聚光器與虹彩光圈：聚光器位于載物臺通光孔下方，由一組透鏡組成，能將反光鏡所反射之光線或照明燈泡之光線匯聚至所觀察的標(biāo)本。載物臺下方有一小螺旋，轉(zhuǎn)動時可升降聚光器。上升時光線強，下降時光線弱。虹彩光圈位于聚光器下方，由多個活動鋼片組成，中心形成圓孔，其外側(cè)有一小手柄，撥動時能調(diào)節(jié)光圈大小，以調(diào)節(jié)光線的強弱。
4）光源：反光鏡或照明燈泡。反光鏡位于鏡座上方，能向各方轉(zhuǎn)動，使光線反射至聚光器；照明燈泡通常安裝在鏡座內(nèi)，其附近有電源開關(guān)及光線強弱調(diào)節(jié)旋鈕。
2. 使用方法
（1）對光：將低倍鏡轉(zhuǎn)到對準(zhǔn)通光孔的位置，上升聚光器，打開光圈，打開電源開關(guān)后轉(zhuǎn)動光線強弱調(diào)節(jié)旋鈕或調(diào)整反光鏡的角度，若用雙目鏡觀察標(biāo)本，應(yīng)用雙眼自目鏡中觀察，調(diào)至整個視野非常明亮為止，同時調(diào)節(jié)兩個目鏡間的距離，直到雙眼看到一共同視野為止。用單目鏡觀察標(biāo)本時，應(yīng)練習(xí)兩眼同時睜開，以減少視覺疲勞；用左眼自目鏡中觀察，右眼用于繪圖和記錄實驗結(jié)果。
（2）置片：將組織切片有蓋玻片的一面朝上，置于載物臺上，將片夾左邊向外拉開，把標(biāo)本玻片平移入片夾內(nèi)，輕輕彈回片夾左邊，卡住固定好標(biāo)本，轉(zhuǎn)動推片器調(diào)節(jié)旋鈕，將觀察目標(biāo)移至通光孔中央。
（3）調(diào)節(jié)焦距：切片放好后，先慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋使載物臺上升，同時雙眼從側(cè)面注視切片與物鏡間距離，當(dāng)物鏡鏡頭與切片相距約0.5cm時，眼睛從目鏡中觀察，邊觀察邊將載物臺慢慢下降，直到物像清晰為止。若物像不夠清晰，可用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)。
（4）低倍物鏡轉(zhuǎn)高倍物鏡：低倍鏡看清物像后，將要觀察的目標(biāo)移至視野中央，直接轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器由低倍鏡轉(zhuǎn)至高倍鏡。轉(zhuǎn)至高倍鏡后，一般即可見模糊的物像，注意此時千萬不要轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋及提升載物臺，只需用細(xì)調(diào)焦螺旋稍加調(diào)整即可見清晰的物像。
（5）油鏡的用法：使用油鏡時，應(yīng)先在高倍鏡下看清物像，并將要觀察的目標(biāo)移至視野中央，移開高倍鏡，在通光孔位置的標(biāo)本上滴一小滴香柏油后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器至油鏡對準(zhǔn)通光孔。從側(cè)面觀察，可見油鏡頭下端與切片上的鏡油充分接觸。此時目鏡內(nèi)觀察一般也可見模糊的物像，緩慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)焦螺旋直至看到清晰物像。
油鏡用完后，先轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋下降載物臺并將油鏡轉(zhuǎn)離通光孔，用干擦鏡紙揩擦鏡頭一次，以去除大部分的油，再用沾有少許清洗劑的擦鏡紙緩慢、仔細(xì)擦拭一次，以將油徹底去除，最后用干擦鏡紙再擦拭一次，以將清洗劑去除。切片的處理方法與油鏡頭相似。
3. 使用注意事項　顯微鏡是精密的光學(xué)儀器，若使用不當(dāng)，常會造成巨大損失，故要求同學(xué)們在使用時必須嚴(yán)格遵守下列規(guī)定：
（1）使用結(jié)束后，先將光調(diào)節(jié)器調(diào)至最小，關(guān)閉電源。
（2）搬動顯微鏡時必須雙手持鏡，以右手握緊鏡臂，左手托住鏡座，平貼胸前，以防撞碰。禁止單手提鏡或使鏡倒轉(zhuǎn)，以免零件落地打破。
（3）使用前應(yīng)檢查顯微鏡的主要部件有無缺損；使用時應(yīng)正確、緩慢的旋動有關(guān)機械部分。
（4）如遇鏡頭模糊不清時，嚴(yán)禁用手或粗布、粗紙等拭擦鏡頭，只能用擦鏡紙輕輕拭擦。
（5）更換切片標(biāo)本時，應(yīng)先轉(zhuǎn)開物鏡，再取出或放置切片標(biāo)本。
（6）使用油鏡時，應(yīng)首先鑒別高倍鏡和油鏡這兩種鏡頭，切勿將油鏡當(dāng)高倍鏡使用。
（7）不要隨便取出目鏡，以免灰塵落入鏡筒內(nèi)影響觀察。
（8）不得自行拆卸修理顯微鏡，如有故障應(yīng)立即報告老師。
（9）顯微鏡用完后，應(yīng)將鏡頭轉(zhuǎn)在交叉位置移離通光孔，載物臺降到最低位置，降下聚光器，蓋好防塵罩放回原處。
二、倒置相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用
1. 成像原理與構(gòu)造　普通光學(xué)顯微鏡一般不能分辨未染色細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這是因為各細(xì)微結(jié)構(gòu)的折光性接近或?qū)Ρ榷炔粔颉５怪孟嗖铒@微鏡，是相差顯微鏡和倒置顯微鏡相結(jié)合的產(chǎn)物，倒置相差顯微鏡既具有倒置顯微鏡的倒置觀察方式，同時又具有與相差顯微鏡相一致的成像原理（圖1-1-3）。
倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，主要包括三部分：機械部分、照明部分、光學(xué)部分。相比于普通顯微鏡，倒置顯微鏡的物鏡與照明聚光系統(tǒng)以載物臺為軸顛倒位置，物鏡在載物臺之下，照明系統(tǒng)在載物臺之上。這樣的構(gòu)造使得照明聚光系統(tǒng)與載物臺的有效距離可以顯著擴大，便于放置培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等較厚的待觀察器具，而同時物鏡與材料之間的工作距離不必很大。一般研究用倒置顯微鏡都配有4×、10×、20×、40×相差物鏡。
相差顯微鏡和普通顯微鏡的主要區(qū)別是用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的相差物鏡（相板能將直射光和衍射光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹�差，使明暗反差加強）代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠(yuǎn)鏡。活細(xì)胞和未染色生物標(biāo)本各部分細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅發(fā)生人眼無法觀察的相位變化（光程差）。相差顯微鏡通過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和相差物鏡改變這種相位差，把相位差變?yōu)檎穹�（光強度）差從而實現(xiàn)觀測。
相差顯微鏡主要用于觀察生長在培養(yǎng)瓶中的活細(xì)胞或未染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色標(biāo)本。
2. 使用方法
（1）開機：打開鏡體下端的電源開關(guān)。
（2）調(diào)節(jié)光源：旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，選擇放大倍數(shù)較小的物鏡，同時調(diào)節(jié)鏡體下端的光線亮度螺旋，并通過調(diào)節(jié)聚光鏡下面的光闌來調(diào)節(jié)光源的大小。
（3）調(diào)節(jié)焦距：將待觀察對象置于載物臺上，慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋使物鏡升降，見到物像后再用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)至物像清晰，并消除或減小圖像周圍的光暈，提高圖像的襯度。調(diào)節(jié)焦距可看到不同焦距水平的細(xì)胞。隨后移動載物臺上的觀察對象，選擇觀察視野并拍照或利用與顯微鏡連接的計算機采集數(shù)碼圖像。根據(jù)需要可轉(zhuǎn)換至高倍鏡觀察。
（4）關(guān)機：取下觀察對象，旋轉(zhuǎn)光源亮度螺旋至最暗。關(guān)閉鏡體下端的電源開關(guān)，并旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡置于載物臺下，防止灰塵沉降其上。
3. 使用注意事項　與普通光學(xué)顯微鏡基本相同。
三、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用
1.成像原理與構(gòu)造　熒光顯微鏡（fluor-escence microscope）也是光學(xué)顯微鏡的一種，由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件（如熒光光源、熒光鏡組件）組成，結(jié)構(gòu)如圖1-1-4所示。熒光顯微鏡的原理是利用高效發(fā)光光源，經(jīng)過慮色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光，激發(fā)檢測樣品內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再經(jīng)物鏡和目鏡進(jìn)行放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。熒光顯微鏡主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及化學(xué)成分等的研究。
熒光顯微鏡由光源、濾色系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成（圖1-1-4）。光源一般采用超高壓汞燈，該燈可發(fā)出各種波長的光，每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用濾色系統(tǒng)僅使一定波長的激發(fā)光經(jīng)物鏡照射至標(biāo)本上。濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用紫外、紫色、藍(lán)色或綠色激發(fā)濾板，分別提供一定波長范圍的激發(fā)光。壓制濾板與激發(fā)濾板相對應(yīng)，其作用是完全阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡，以免干擾熒光和損傷眼睛，同時讓特異波長范圍的熒光選擇透過，以顯示專一的熒光色彩。故壓制濾板與激發(fā)濾板必須選擇配合使用。
熒光顯微鏡按照明方式可分為落射式和透射式兩類。落射式熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，透射式熒光顯微鏡較為原始，其激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。目前熒光顯微鏡照明方式通常為落射式，其成像原理是激發(fā)光通過雙色束分離器反射至物鏡，向下落射到標(biāo)本表面，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光被壓制濾板吸收，因此物鏡同時具有照明聚光器和收集熒光的作用（圖1-1-5）。
2. 使用方法
（1）開機：打開紫外燈電源，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到最亮點。
（2）選擇相應(yīng)的濾色系統(tǒng)：透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾板，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾板。落射式熒光顯微鏡需根據(jù)樣品的熒光指示劑，在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾板、雙色束分離器、壓制濾板的插塊即旋轉(zhuǎn)熒光組件室數(shù)碼圓盤，以滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要，分別對應(yīng)如下：
WB——適用于FITC熒光抗體染色的樣品觀察，陽性染色為綠色。
WG——適用PE或Cy3熒光抗體和羅丹明染色的樣品觀察，陽性染色為紅色。
WU——適用于紫外光熒光染色的樣品觀察，陽性染色為藍(lán)色。
（3）調(diào)節(jié)光源：將熒光指示劑標(biāo)記好的樣品放存載物臺后，低倍鏡對準(zhǔn)通光孔，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。
（4）調(diào)焦距：按照普通光學(xué)顯微鏡的使用方法調(diào)焦距至物像清晰為止。根據(jù)需要可轉(zhuǎn)換至高倍鏡或油鏡觀察。同時利用與顯微鏡連接的計算機采集數(shù)碼圖像。
3. 注意事項
（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5
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