第六章

結(jié)核病分子生物學(xué)診斷第一節(jié) 分子生物學(xué)常用技術(shù)

分子生物學(xué)診斷方法多基于核酸擴(kuò)增、雜交和測(cè)序等基本技術(shù)，其應(yīng)用于

結(jié)核病診斷目前已經(jīng)獲得WHO 認(rèn)可。目前結(jié)核病的分子生物學(xué)診斷仍集中在以核酸擴(kuò)增為核心的檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用上，下面將對(duì)近幾年應(yīng)用于結(jié)核病診斷的分子生物學(xué)技術(shù)做詳細(xì)闡述。

一、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)

核酸擴(kuò)增試驗(yàn)（nucleic acid amplification tests，NAATs）是通過(guò)特異性

地?cái)U(kuò)增核酸靶序列來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，是結(jié)核病診斷技術(shù)中一種重要而快速的分子診斷工具。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心Centers for Disease Control and

Prevention，CDC）建議所有結(jié)核病疑似患者的第一份痰標(biāo)本均進(jìn)行NAATs。

目前已經(jīng)通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局（US Food and Drug Administration，

FDA）認(rèn)證且應(yīng)用較廣的試劑盒有Gen-Probe Amplified Mtb Direct test、Roche AmplicorMtb test、COBAS Amplicor、BD-ProbeTec Direct等。一項(xiàng)綜合125項(xiàng)研究的最新文獻(xiàn)顯示：NAATs的總靈敏度和總特異性分別為85%和7%，然而這些研究結(jié)果的差異較大，靈敏度在36%～100%，特異性在54%～100％，NAATs的應(yīng)用受到不同地區(qū)技術(shù)水平和儀器設(shè)備的制約。

二、Xpert® MTB/RIF

Xpert® MTB/RIF（Cepheid, Sunnyvale, CA）是由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)出的一款基于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的快速全自動(dòng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可直接進(jìn)行痰標(biāo)本檢測(cè)，是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染和RIF耐藥基因的、以反應(yīng)盒為基礎(chǔ)的模塊化平臺(tái)。擴(kuò)增的靶基因?yàn)槔�福平耐藥相關(guān)基因的81個(gè)堿基對(duì)的高突變熱點(diǎn)區(qū)域。Xpert® TB/RIF 技術(shù)包括樣本處理、opB基因半巢式實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增和

數(shù)據(jù)自動(dòng)評(píng)分共3個(gè)步驟。整個(gè)過(guò)程約2小時(shí)，僅需兩步操作，其余均為全自動(dòng)化檢測(cè)，4模塊平臺(tái)每8小時(shí)工作時(shí)間可完成16個(gè)樣本。目前最大的全自動(dòng) INFINITI® Xpert®平臺(tái)具有80個(gè)模塊，全天可完成超過(guò)1000個(gè)樣本。該技術(shù)檢測(cè)底線為每毫升痰100條細(xì)菌。

WHO已于2010年底批準(zhǔn)其應(yīng)用，推薦其為診斷肺結(jié)核和耐藥結(jié)核病的輔

助手段，并制定了指南。截止2012年7月，2/3的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家、1/2的耐多藥結(jié)核�。╩ultidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB）高負(fù)擔(dān)國(guó)家均把Xpert®

MTB/RIF列入國(guó)家結(jié)核病規(guī)劃指南。由于其用于診斷MDR-TB和合并HIV感染結(jié)核病的成本低于傳統(tǒng)方法，很多國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)其用于檢測(cè)MDR-TB和合并HIV感染的結(jié)核病。2013年7月，Xpert® MTB/RIF已通過(guò)美國(guó)FDA的認(rèn)證。