第一章緒論001
第一節(jié)PCR發(fā)展簡(jiǎn)史001
第二節(jié)PCR技術(shù)的基本原理和操作002
一、PCR的基本原理002
二、PCR的基本成分002
三、PCR的基本操作005
第三節(jié)PCR的主要應(yīng)用006
一、基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用006
二、臨床上的應(yīng)用007
三、在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用008
四、在其它方面的應(yīng)用008
參考文獻(xiàn)009

第二章擴(kuò)增已知序列兩側(cè)DNA的PCR011
第一節(jié)反向PCR011
一、引言011
二、基本原理011
三、材料012
四、方法013
五、注意事項(xiàng)014
六、應(yīng)用015
七、小結(jié)017
第二節(jié)錨定PCR018
一、引言018
二、原理018
三、用連接錨定PCR從基因文庫(kù)中擴(kuò)增已知基因側(cè)翼序列020
四、用互補(bǔ)錨定PCR直接擴(kuò)增已知序列側(cè)翼cDNA序列021
五、問(wèn)題及對(duì)策025
六、小結(jié)026
第三節(jié)RACE——cDNA末端的快速擴(kuò)增027
一、引言027
二、RACE基本原理028
三、實(shí)驗(yàn)方案030
四、RACE的應(yīng)用033
五、小結(jié)034
第四節(jié)連接介導(dǎo)的PCR034
一、引言034
二、原理034
三、材料035
四、操作步驟035
五、注意事項(xiàng)038
六、應(yīng)用039
七、小結(jié)042
第五節(jié)Bubble-PCR042
一、引言042
二、原理042
三、材料與方法043
四、注意事項(xiàng)044
五、應(yīng)用045
六、小結(jié)045
參考文獻(xiàn)045

第三章巢式PCR048
第一節(jié)常規(guī)巢式PCR048
一、引言048
二、原理048
三、材料049
四、方法049
五、注意事項(xiàng)050
六、應(yīng)用與小結(jié)050
第二節(jié)半巢式PCR050
一、引言050
二、材料050
三、方法051
四、注意事項(xiàng)051
五、應(yīng)用與小結(jié)052
第三節(jié)反轉(zhuǎn)錄巢式PCR052
一、引言052
二、材料052
三、方法052
四、注意事項(xiàng)054
五、應(yīng)用054
第四節(jié)共有序列巢式PCR054
一、引言054
二、材料055
三、方法055
四、注意事項(xiàng)056
五、應(yīng)用與小結(jié)056
第五節(jié)種特異巢式PCR056
一、引言056
二、材料057
三、方法057
四、注意事項(xiàng)058
五、應(yīng)用與小結(jié)058
第六節(jié)巢式PCR-變性梯度凝膠電泳058
一、引言058
二、材料059
三、方法059
四、注意事項(xiàng)060
五、應(yīng)用與小結(jié)060
第七節(jié)巢式PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性061
一、引言061
二、材料061
三、方法062
四、注意事項(xiàng)063
五、應(yīng)用與小結(jié)063
參考文獻(xiàn)063

第四章實(shí)時(shí)熒光定量PCR065
第一節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理065
一、引言065
二、概念及原理065
第二節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的熒光化學(xué)物質(zhì)067
一、引言067
二、熒光染料067
三、水解探針068
四、分子信標(biāo)069
五、雙雜交探針071
六、復(fù)合探針071
第三節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法072
一、絕對(duì)定量072
二、相對(duì)定量073
第四節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法076
一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR076
二、實(shí)時(shí)定量RT-PCR079
三、多重實(shí)時(shí)定量PCR081
四、多重實(shí)時(shí)定量RT-PCR084
五、實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化086
六、實(shí)踐中應(yīng)注意的問(wèn)題087
第五節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用088
一、在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用089
二、在腫瘤研究中的應(yīng)用090
三、在基因表達(dá)研究中的應(yīng)用092
四、在細(xì)胞因子表達(dá)分析中的應(yīng)用092
五、在遺傳學(xué)及SNP分析上的應(yīng)用092
六、小結(jié)093
參考文獻(xiàn)094

第五章致突變PCR097
第一節(jié)利用易錯(cuò)DNA聚合酶進(jìn)行隨機(jī)突變098
一、原理098
二、實(shí)驗(yàn)方案098
三、注意事項(xiàng)100
四、討論100
五、應(yīng)用101
第二節(jié)利用PCR引物構(gòu)建位點(diǎn)特異突變體102
一、方法1：利用重疊延伸PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變體102
二、方法2：利用大引物PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變體105
三、方法3：利用重組PCR進(jìn)行掃描突變107
四、討論111
五、應(yīng)用112
六、小結(jié)113
參考文獻(xiàn)113

第六章測(cè)定基因突變的PCR115
第一節(jié)多重PCR115
一、引言115
二、原理116
三、材料116
四、方法116
五、常見(jiàn)問(wèn)題的解決120
六、應(yīng)用121
七、小結(jié)128
第二節(jié)常用的等位基因特異性PCR128
一、引言128
二、原理129
三、材料130
四、方法130
五、注意事項(xiàng)131
六、對(duì)等位基因特異PCR的改進(jìn)131
七、應(yīng)用與小結(jié)132
第三節(jié)簡(jiǎn)單等位基因辨別PCR133
一、引言133
二、原理133
三、材料134
四、方法135
五、注意事項(xiàng)136
六、應(yīng)用與小結(jié)136
第四節(jié)L-DNA標(biāo)記的等位基因特異性PCR136
一、引言136
二、原理137
三、材料137
四、方法138
五、注意事項(xiàng)139
六、應(yīng)用與小結(jié)139
第五節(jié)同源一步熒光等位基因特異性PCR139
一、引言139
二、原理139
三、材料140
四、方法141
五、注意事項(xiàng)142
六、應(yīng)用與小結(jié)142
第六節(jié)低溫變性共擴(kuò)增PCR142
一、引言142
二、原理143
三、材料144
四、方法144
五、小結(jié)145
第七節(jié)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR145
一、原理145
二、材料145
三、操作方法146
四、注意事項(xiàng)147
五、應(yīng)用148
第八節(jié)PCR-變性梯度凝膠電泳149
一、原理149
二、材料149
三、操作方法149
四、注意事項(xiàng)151
五、應(yīng)用151
參考文獻(xiàn)152

第七章測(cè)序和DNA合成PCR156
第一節(jié)不對(duì)稱PCR156
一、引言156
二、引物濃度不對(duì)稱PCR156
三、熱（引物長(zhǎng)度）不對(duì)稱PCR158
四、應(yīng)用162
五、小結(jié)163
第二節(jié)PCR測(cè)序法164
一、直接測(cè)序法164
二、循環(huán)測(cè)序法165
三、全自動(dòng)DNA測(cè)序法167
四、應(yīng)用167
第三節(jié)乳化液PCR168
一、引言168
二、原理168
三、材料和方法169
四、應(yīng)用177
五、小結(jié)177
第四節(jié)基于PCR的大片段DNA的合成177
一、引言177
二、基本原理178
三、目的序列、寡核苷酸和測(cè)序引物的設(shè)計(jì)178
四、操作步驟180
五、DNA合成時(shí)常出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法184
六、小結(jié)184
參考文獻(xiàn)184

第八章免疫PCR188
第一節(jié)免疫PCR技術(shù)188
一、引言188
二、基本原理188
三、材料和試劑190
四、方法191
五、注意事項(xiàng)196
六、應(yīng)用197
七、小結(jié)198
第二節(jié)免疫捕捉PCR198
一、引言198
二、基本原理198
三、材料199
四、方法199
五、注意事項(xiàng)201
六、應(yīng)用202
七、小結(jié)204
第三節(jié)PCR-ELISA205
一、引言205
二、原理205
三、材料206
四、方法207
五、注意事項(xiàng)208
六、應(yīng)用208
七、小結(jié)211
第四節(jié)原位PCR211
一、引言211
二、基本原理211
三、原位PCR方法分類及其設(shè)計(jì)方案212
四、原位PCR基本步驟214
五、原位PCR方法的選擇216
六、原位PCR操作注意事項(xiàng)217
七、原位PCR存在的問(wèn)題和結(jié)果分析218
八、原位PCR的應(yīng)用219
九、原位PCR操作程序示例220
十、小結(jié)222
參考文獻(xiàn)223

第九章PCR芯片227
第一節(jié)PCR芯片的結(jié)構(gòu)及其工作原理227
一、引言227
二、原理227
三、方法230
四、應(yīng)用230
五、小結(jié)231
第二節(jié)納升高通量PCR231
一、引言231
二、原理232
三、材料232
四、方法233
五、注意事項(xiàng)233
六、應(yīng)用234
七、小結(jié)234
第三節(jié)微流控PCR234
一、引言234
二、原理235
三、材料（以不對(duì)稱螺旋管芯片微流控PCR為例）236
四、方法（以不對(duì)稱螺旋管芯片微流控PCR為例）236
五、應(yīng)用236
六、小結(jié)237
第四節(jié)連續(xù)流熱梯度PCR237
一、引言237
二、原理237
三、材料238
四、操作方法238
五、注意事項(xiàng)238
六、應(yīng)用238
七、小結(jié)239
第五節(jié)PCR芯片的應(yīng)用239
一、引言239
二、應(yīng)用240
三、注意事項(xiàng)242
四、小結(jié)243
參考文獻(xiàn)243

第十章數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)方法245
第一節(jié)數(shù)字PCR概述245
一、引言245
二、數(shù)字PCR系統(tǒng)分類247
第二節(jié)數(shù)字PCR技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)分析249
一、PCR微流控芯片249
二、連續(xù)流PCR微流控芯片251
三、微滴PCR技術(shù)252
四、微閥、微泵和微混合器與PCR微流控芯片的關(guān)系255
五、dPCR與液滴微流控芯片的結(jié)合和應(yīng)用256
第三節(jié)數(shù)字PCR的應(yīng)用257
一、在突變檢測(cè)方面的應(yīng)用257
二、病毒載量的絕對(duì)定量操作方法271
參考文獻(xiàn)277

第十一章核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、方法及應(yīng)用278
第一節(jié)聚合酶螺旋擴(kuò)增技術(shù)的原理、方法及應(yīng)用280
一、基本原理280
二、方法281
三、結(jié)果分析286
四、注意事項(xiàng)289
五、小結(jié)289
第二節(jié)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、方法及應(yīng)用289
一、基本原理290
二、方法292
三、結(jié)果分析299
四、注意事項(xiàng)302
五、應(yīng)用302
六、小結(jié)302
第三節(jié)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的原理、方法及應(yīng)用304
一、基本原理304
二、器材306
三、實(shí)驗(yàn)方法306
四、結(jié)果分析309
五、注意事項(xiàng)311
六、應(yīng)用312
七、小結(jié)313
參考文獻(xiàn)313

第十二章其它PCR方法316
第一節(jié)高（G＋C）含量DNA的PCR擴(kuò)增316
一、使用增強(qiáng)劑改善高（G＋C）含量DNA模板的PCR擴(kuò)增317
二、NaOH對(duì)模板進(jìn)行預(yù)處理改善高（G+C）含量DNA的PCR擴(kuò)增320
三、利用高溫PCR體系改善高（G+C）含量DNA模板的PCR擴(kuò)增321
四、應(yīng)用322
五、小結(jié)322
第二節(jié)長(zhǎng)片段PCR323
一、引言323
二、原理323
三、材料323
四、方法324
五、注意事項(xiàng)325
六、應(yīng)用327
七、小結(jié)329
第三節(jié)利用熱激活引物進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR330
一、引言 330
二、原理330
三、材料331
四、方法331
五、注意事項(xiàng)333
六、應(yīng)用333
七、小結(jié)336
第四節(jié)融合PCR337
一、引言337
二、融合PCR的原理337
三、應(yīng)用于基因插入的融合PCR的具體操作步驟337
四、融合PCR的應(yīng)用338
五、融合PCR操作方法的注意事項(xiàng)341
六、小結(jié)343
第五節(jié)不依賴連接反應(yīng)的克隆PCR343
一、引言343
二、基本原理343
三、材料345
四、方法346
五、注意事項(xiàng)346
六、應(yīng)用346
第六節(jié)菌落PCR348
一、引言348
二、原理348
三、材料349
四、操作方法349
五、注意事項(xiàng)349
六、應(yīng)用349
七、小結(jié)350
參考文獻(xiàn)350

第十三章PCR在基因分型中的應(yīng)用353
第一節(jié)任意引物PCR353
一、引言353
二、任意引物PCR的基本原理及技術(shù)特點(diǎn)353
三、AP-PCR 方法354
四、RAP-PCR方法355
五、注意事項(xiàng)356
六、應(yīng)用356
七、小結(jié)361
第二節(jié)通用PCR361
一、引言361
二、原理361
三、材料362
四、方法362
五、注意事項(xiàng)363
六、應(yīng)用364
七、小結(jié)365
第三節(jié)rep-PCR365
一、引言365
二、原理366
三、材料366
四、方法366
五、注意事項(xiàng)369
六、應(yīng)用370
七、小結(jié)372
第四節(jié)序列特異性引物PCR372
一、引言372
二、原理373
三、材料373
四、方法373
五、注意事項(xiàng)376
六、應(yīng)用與小結(jié)376
第五節(jié)簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間PCR376
一、引言376
二、原理377
三、材料377
四、方法378
五、注意事項(xiàng)379
六、應(yīng)用379
七、小結(jié)380
第六節(jié)鉗制PCR380
一、引言380
二、原理380
三、材料381
四、方法381
五、注意事項(xiàng)382
六、應(yīng)用382
第七節(jié)序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR382
一、原理382
二、試劑383
三、方法384
四、注意事項(xiàng)387
五、應(yīng)用388
參考文獻(xiàn)389

第十四章PCR在臨床診斷及流行病調(diào)查中的應(yīng)用394
第一節(jié)表位特異PCR394
一、引言394
二、原理394
三、材料394
四、方法395
五、應(yīng)用395
六、小結(jié)395
第二節(jié)雙標(biāo)記PCR396
一、引言396
二、原理396
三、材料396
四、方法397
五、應(yīng)用397
六、注意事項(xiàng)397
第三節(jié)降落PCR397
一、引言397
二、原理398
三、材料398
四、方法398
五、降落PCR與常規(guī)PCR的比較399
六、應(yīng)用401
七、小結(jié)402
第四節(jié)16S rRNA PCR402
一、引言402
二、原理402
三、材料及設(shè)備403
四、方法403
五、注意事項(xiàng)405
六、應(yīng)用405
七、小結(jié)407
第五節(jié)PCR偶聯(lián)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)407
一、原理407
二、材料408
三、方法409
四、注意事項(xiàng)410
五、應(yīng)用411
第六節(jié)快速PCR412
一、引言412
二、原理412
三、實(shí)驗(yàn)方法414
四、應(yīng)用416
五、小結(jié)417
第七節(jié)稀有限制性位點(diǎn)PCR418
一、引言418
二、原理418
三、材料420
四、方法420
五、注意事項(xiàng)421
六、應(yīng)用422
七、小結(jié)422
參考文獻(xiàn)423

第十五章PCR在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用426
第一節(jié)小衛(wèi)星可變重復(fù)序列PCR426
一、引言426
二、原理427
三、方法428
四、應(yīng)用431
五、小結(jié)433
第二節(jié)短串聯(lián)重復(fù)序列的PCR433
一、引言433
二、原理434
三、材料435
四、方法436
五、注意事項(xiàng)440
六、應(yīng)用441
七、小結(jié)442
第三節(jié)單核苷酸多態(tài)性PCR444
一、引言444
二、原理445
三、材料及方法447
四、SNP-PCR檢測(cè)方法448
五、數(shù)據(jù)庫(kù)451
六、應(yīng)用452
七、小結(jié)454
第四節(jié)全基因組PCR455
一、引言455
二、全基因組PCR的種類455
三、基因組DNA模板的制備460
四、不同WGA方法的比較461
五、WGA的產(chǎn)物分析及應(yīng)用461
六、小結(jié)464
第五節(jié)單分子PCR464
一、引言464
二、原理465
三、材料465
四、方法465
五、注意事項(xiàng)465
六、SM-PCR的應(yīng)用466
七、小結(jié)467
參考文獻(xiàn)467

第十六章PCR在癌癥診斷中的應(yīng)用474
第一節(jié)甲基化特異PCR474
一、引言474
二、基本原理474
三、材料475
四、方法475
五、注意事項(xiàng)477
六、應(yīng)用478
七、小結(jié)479
第二節(jié)差異顯示PCR479
一、引言479
二、原理480
三、方法481
四、應(yīng)用484
五、小結(jié)487
第三節(jié)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性487
一、原理487
二、材料488
三、方法488
四、注意事項(xiàng)490
五、應(yīng)用491
第四節(jié)單細(xì)胞PCR492
一、引言492
二、基本原理493
三、材料和方法493
四、注意事項(xiàng)497
五、應(yīng)用498
六、小結(jié)498
第五節(jié)PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性498
一、引言498
二、基本原理499
三、材料499
四、方法500
五、注意事項(xiàng)501
六、應(yīng)用502
七、小結(jié)與展望502
參考文獻(xiàn)503

第十七章PCR在動(dòng)物學(xué)中的應(yīng)用507
第一節(jié)微衛(wèi)星PCR在動(dòng)物分類和進(jìn)化中的應(yīng)用507
一、引言507
二、基本原理507
三、材料508
四、方法508
五、注意事項(xiàng)509
六、應(yīng)用509
七、小結(jié)510
第二節(jié)巢式PCR在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用510
一、引言510
二、基本原理510
三、材料511
四、方法511
五、注意事項(xiàng)512
六、應(yīng)用512
七、小結(jié)513
第三節(jié)T接頭介導(dǎo)PCR在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因定位中的應(yīng)用513
一、引言513
二、原理513
三、材料514
四、方法514
五、注意事項(xiàng)515
六、應(yīng)用516
七、小結(jié)516
第四節(jié)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物學(xué)中的應(yīng)用516
一、引言516
二、基本原理516
三、材料518
四、方法519
五、注意事項(xiàng)520
六、應(yīng)用520
七、小結(jié)521
參考文獻(xiàn)521

第十八章PCR技術(shù)在基因修飾動(dòng)物研究中的應(yīng)用523
第一節(jié)PCR技術(shù)在基因修飾動(dòng)物基因型鑒定中的應(yīng)用523
一、引言523
二、基本原理524
三、材料524
四、方法524
五、注意事項(xiàng)526
第二節(jié)PCR技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中外源基因整合位點(diǎn)的分析526
一、方案一：反向PCR527
二、方案二：連接介導(dǎo)PCR法528
三、方案三：熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR529
第三節(jié)PCR技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中外源基因整合拷貝數(shù)的分析532
一、方案一：實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較CT法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的拷貝數(shù)532
二、方案二：實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的拷貝數(shù)534
三、方案三：利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因的拷貝數(shù)535
參考文獻(xiàn)537

第十九章實(shí)時(shí)熒光定量PCR在動(dòng)物疫病定量檢測(cè)中的應(yīng)用538
第一節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在大家畜（豬、牛、羊）傳染病中的診斷應(yīng)用538
一、引言538
二、原理538
三、器材540
四、方法540
五、注意事項(xiàng)541
六、應(yīng)用543
七、小結(jié)545
第二節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在家禽傳染�。ㄇ萘鞲校┲械脑\斷應(yīng)用545
一、引言545
二、原理546
三、材料547
四、方法547
五、結(jié)果分析548
六、注意事項(xiàng)548
七、應(yīng)用549
八、小結(jié)550
第三節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在水生動(dòng)物疫病定量檢測(cè)中的應(yīng)用550
一、引言550
二、基本原理550
三、材料550
四、方法551
五、注意事項(xiàng)552
六、應(yīng)用552
七、小結(jié)554
參考文獻(xiàn)555

第二十章PCR在植物學(xué)中的應(yīng)用557
第一節(jié)ISSR-PCR在植物分類學(xué)中的應(yīng)用557
一、引言557
二、基本原理557
三、材料557
四、方法558
五、注意事項(xiàng)559
六、應(yīng)用559
七、小結(jié)566
第二節(jié)TAIL-PCR在轉(zhuǎn)基因植物研究中的應(yīng)用567
一、引言567
二、基本原理567
三、材料568
四、方法568
五、注意事項(xiàng)569
六、應(yīng)用570
七、小結(jié)575
第三節(jié)多重PCR在植物基因檢測(cè)中的應(yīng)用575
一、引言575
二、基本原理576
三、多重PCR的實(shí)驗(yàn)方法576
四、多重PCR設(shè)計(jì)方法及注意事項(xiàng)577
五、多重PCR在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用579
六、多重PCR應(yīng)用前景580
參考文獻(xiàn)580